Cách tối ưu hóa các phương pháp HPLC để phân tách và độ chính xác tốt hơn

Hướng dẫn kỹ thuật dành cho người quản lý phòng thí nghiệm, nhà phát triển phương pháp và nhóm mua sắm HPLC

Việc phân tách HPLC tốt hơn hiếm khi đến từ việc thay đổi một cài đặt một cách ngẫu nhiên. Bắt đầu bằng cách xác định cặp tới hạn, giới hạn báo cáo được yêu cầu và tiêu chí chấp nhận; sau đó sàng lọc độ chọn lọc, thành phần hữu cơ, độ pH, tốc độ dòng chảy, lượng phun và nhiệt độ theo thứ tự đó. Đối với công việc thường ngày, một phương pháp đẳng cấp ổn định thường dễ dàng được chuyển giao và xác nhận hơn. Khi các hợp chất rửa giải muộn hoặc phạm vi phân cực rộng làm cho thời gian chạy quá mức, độ dốc có thể hợp lý. Mục tiêu thực tế là một phương pháp giải quyết các đỉnh tới hạn với khả năng lưu giữ và diện tích cực đại có thể lặp lại, trong khi vẫn nằm trong giới hạn áp suất, máy dò, cột và mẫu của thiết bị của bạn.

1. Xác định bài toán tách trước khi thay đổi điều kiện

Ghi lại các triệu chứng: đồng rửa giải, bám đuôi, lưu giữ trôi, áp suất ngược, phản ứng yếu hoặc thời gian chạy quá mức. Xác định cặp đỉnh quan trọng đối với quyết định phát hành hoặc nghiên cứu. Cải thiện một tạp chất nhỏ trong khi hy sinh cặp đó không phải là một cải tiến.

Đặt các mục tiêu có thể đo lường được: độ lặp lại lưu giữ, độ chính xác của khu vực, độ phân giải cặp quan trọng, phần đuôi, tấm và thời gian chu kỳ. Ghi lại dung môi, nồng độ, thể tích tiêm, kích thước cột, chất phụ gia và bước sóng để có thể tách biệt những thay đổi về độ chọn lọc khỏi sự biến thiên của quá trình chuẩn bị.

2. Thay đổi độ chọn lọc trước: cột hóa học, pH và dung môi hữu cơ

Tính chọn lọc thường có nhiều đòn bẩy hơn so với việc điều chỉnh tốc độ dòng chảy nhỏ. Đối với các xét nghiệm pha đảo, hãy so sánh các pha tĩnh với kích thước và kích thước hạt được kiểm soát. C18 là điểm khởi đầu hữu ích, không phải là câu trả lời phổ quát; các chất phân tích cơ bản, axit và phân cực cao có thể cần một hệ thống pha hoặc phụ gia khác.

Kiểm soát độ pH bằng dung dịch đệm xác định và xác minh rằng độ pH cuối cùng được đo trong thành phần nước dự định. Sự thay đổi pH nhỏ có thể làm thay đổi quá trình ion hóa chất phân tích và do đó làm thay đổi khả năng lưu giữ và chọn lọc. Giữ nồng độ đệm, thứ tự chuẩn bị, lọc và bảo quản nhất quán. Nếu phương pháp sử dụng các chất phụ gia dễ bay hơi, hãy kiểm tra tính tương thích của máy dò và độ sạch của nguồn trước khi so sánh kết quả.

Sàng lọc nhận dạng và tỷ lệ dung môi riêng biệt. Acetonitril và metanol có thể cho thấy độ chọn lọc khác nhau ở cường độ rửa giải tương tự. Thay đổi từng yếu tố một hoặc sử dụng một thiết kế nhỏ, sau đó xác nhận kết quả bằng pha động mới. Dung môi mạnh hơn có thể rút ngắn thời gian chạy nhưng nén cặp tới hạn.

3. Chọn hoạt động đẳng cấp hoặc gradient một cách có chủ ý

Sử dụng phương pháp rửa giải đẳng cấp khi mẫu có cửa sổ lưu giữ hẹp và việc chuyển giao đơn giản là vấn đề quan trọng. Thành phần liên tục giúp đơn giản hóa việc cân bằng và xử lý sự cố. Rửa giải gradient giúp ích khi các pic sớm cần điều kiện yếu nhưng các hợp chất muộn lại tạo ra đuôi dài; nó thêm các biến thể tích dừng và cân bằng lại.

Đối với công việc đẳng cấp, hãy tối ưu hóa tỷ lệ phần trăm tự nhiên xung quanh cặp quan trọng và xác minh mức độ giữ chân ở đỉnh đầu tiên đầy đủ. Đối với gradient, xác định thành phần ban đầu, thời gian tăng dần, rửa và tái cân bằng. Nếu thể tích dừng khác nhau giữa các thiết bị, hãy khớp thời gian ở đầu vào cột thay vì chỉ sao chép bảng đã lập trình.

4. Điều chỉnh tốc độ dòng chảy và áp suất trong cửa sổ được kiểm soát

Tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến hiệu quả, áp suất và thời gian phân tích. Bắt đầu ở gần phạm vi khuyến nghị của nhà cung cấp cột, sau đó kiểm tra cửa sổ hẹp từ thấp đến cao trong khi xem độ phân giải và áp suất ngược. Lưu lượng thấp hơn có thể cải thiện hiệu quả trong một số điều kiện nhưng lại kéo dài thời gian chạy; lưu lượng cao hơn có thể tăng thông lượng trong khi giảm hiệu suất hoặc vượt quá giới hạn áp suất. Hãy coi áp lực là một hạn chế khó khăn trong vận hành chứ không phải là mục tiêu về hiệu quả hoạt động.

ChroMini HPLC LC-80MI có phạm vi tốc độ dòng chảy 0,001-5,000 mL/phút, độ chính xác dòng chảy <= +/- 0,1% trong điều kiện thử nghiệm đã nêu, độ chính xác dòng chảy RSD <= 0,5% và áp suất tối đa 5800 psi. Các giá trị được công bố đó giúp xác định cửa sổ sàng lọc phía thiết bị nhưng chúng không thay thế xác nhận rằng cột, độ nhớt, nhiệt độ và pha động đã chọn của bạn vẫn nằm trong giới hạn an toàn. Ghi lại áp suất ở phương pháp cuối cùng, sau khi cân bằng và bằng một hệ thống sạch để độ lệch trong tương lai dễ chẩn đoán hơn.

5. So khớp phương pháp tiêm, phát hiện và nhiệt độ với mẫu

Thể tích phun và nồng độ dung môi có thể tạo ra các đỉnh nhọn, tách hoặc biến dạng sớm. Giữ dung môi mẫu không mạnh hơn pha động ban đầu khi thực tế, giảm thể tích phun đối với các pic quá tải và xác nhận nồng độ so với phạm vi làm việc tuyến tính của máy dò. Chuẩn bị các lọ lặp lại từ cùng một dung dịch trước khi thay đổi điều kiện sắc ký; nếu không thì sự biến đổi trong quá trình chuẩn bị có thể được coi là vấn đề phân tách.

Đặt bước sóng UV từ phổ chất phân tích hoặc phương pháp đã được xác nhận, không phải từ giá trị mặc định chung. Wincom LC-80MI chỉ định phạm vi dò UV là 190-680 nm và liệt kê độ chính xác bước sóng là +/- 1 nm và độ chính xác dưới 0,1 nm. Đây là những thông tin hữu ích về công cụ để lập kế hoạch phương pháp, trong khi độ nhạy thực tế vẫn phụ thuộc vào độ hấp thụ của chất phân tích, nồng độ, điều kiện dòng chảy và độ nhiễu trong phương pháp hoàn chỉnh.

Nhiệt độ có thể ổn định độ nhớt và khả năng lưu giữ, nhưng nó không tự động khắc phục được tình trạng chọn lọc kém. Ngăn cột điều nhiệt của LC-80MI là tùy chọn. Xác nhận phạm vi, độ ổn định, bằng chứng hiệu chuẩn và khả năng tương thích với cột và pha động của bạn trước khi chỉ định.

6. Xác minh phương pháp được tối ưu hóa bằng kiểm tra tính phù hợp và độ tin cậy của hệ thống

Sau khi chọn các điều kiện, hãy chạy các nội dung tiêm tiêu chuẩn hoặc phù hợp với hệ thống sao chép. Xác định giới hạn trước khi xem xét kết quả. Theo dõi độ phân giải cặp quan trọng, khả năng lặp lại lưu giữ, độ chính xác của khu vực, việc cắt đuôi và số lượng đĩa. Tiêm mẫu trắng để mang sang và chuẩn bị nền mẫu đại diện cho nhiễu.

Kiểm tra độ bền xung quanh điểm đặt về tỷ lệ phần trăm hữu cơ, pH, lưu lượng, nhiệt độ, bước sóng và thể tích phun. Sử dụng những thay đổi thực tế và xác định biến số có thể đe dọa đến kết quả quan trọng trước tiên. Lô cột tài liệu, chuẩn bị pha động, thể tích cân bằng, cấu hình và quy tắc xử lý.

⭐ Hệ thống HPLC nhỏ gọn được đề xuất | Wincom ChroMini HPLC LC-80MI

ChroMini HPLC LC-80MI của chúng tôi là hệ thống đẳng cấp tất cả trong một kết hợp bơm LC-80, máy dò UV80, kim phun thủ công 7725i, trạm làm việc WS-80 và cột C18 5 µm ID 4,6×250 mm. Cấu hình của nó cung cấp khả năng kiểm soát lưu lượng 0,001-5,000 mL/phút, áp suất tối đa lên tới 5800 psi và phát hiện tia cực tím từ 190-680 nm.

Sử dụng Trang sản phẩm ChroMini HPLC LC-80MI để kiểm tra cấu hình được liệt kê, sau đó gửi cho chúng tôi tên chất phân tích, thành phần hóa học cột, công thức pha động, nồng độ, thể tích tiêm, độ phân giải mục tiêu và lượng mẫu dự kiến ​​thông qua trang liên hệ . Sau đó, chúng tôi có thể xác nhận xem cấu hình đã công bố có phải là điểm khởi đầu thích hợp hay không, liệu có cần ngăn cột điều chỉnh nhiệt tùy chọn hay không và tài liệu hoặc phụ kiện nào nên được đưa vào báo giá.

Kiểm tra tối ưu hóa phương pháp trong nháy mắt

Câu hỏi thường gặp:

Khi nào tôi nên chuyển từ HPLC đẳng cấp sang HPLC gradient?

Chuyển đổi khi thành phần không đổi không thể giữ lại đầy đủ các hợp chất sớm và rửa giải các hợp chất muộn trong thời gian chu kỳ hợp lý hoặc khi độ chọn lọc trên phạm vi mẫu vẫn kém. Nếu sự đơn giản trong quá trình truyền tải và tính mạnh mẽ thông thường chiếm ưu thế, hãy giữ một phương pháp đẳng cấp ở nơi nó đáp ứng được mục tiêu cặp quan trọng. Chúng tôi có thể xem xét độ dốc được đề xuất với kích thước cột, thể tích dừng và yêu cầu cân bằng lại thông qua Danh mục thiết bị HPLC .

LC-80MI có thể hỗ trợ phương pháp cần phát hiện tia UV dưới 200 nm không?

Phạm vi UV80 được công bố là 190-680 nm, do đó phương pháp yêu cầu bước sóng trong khoảng đó nằm trong phạm vi máy dò đã nêu. Xác nhận phản ứng của chất phân tích, độ hấp thụ pha động, điều kiện tế bào dòng chảy và khả năng chấp nhận tiếng ồn bằng thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống trước khi xử lý phương pháp như đã được xác thực. Xem Thông số kỹ thuật LC-80MI .

Cột C18 được cung cấp có phù hợp với mọi xét nghiệm HPLC không?

Không. Cột C18 5 µm, 4,6×250 mm được liệt kê là cấu hình ban đầu được xác định, không phải là bằng chứng về khả năng tương thích chung của chất phân tích. Cung cấp độ phân cực của chất phân tích, pKa, ma trận, độ phân giải mục tiêu và bất kỳ dung môi bị hạn chế nào để chúng tôi có thể xác nhận xem cột được cung cấp có phù hợp hay cần trích dẫn một pha tĩnh khác. Bắt đầu với phạm vi thiết bị phòng thí nghiệm và bao gồm những điều kiện đó trong yêu cầu của bạn.